【摘要】　目的　了解白癜风黑素细胞的消失与角朊细胞产生的内皮素-1(ET-1)水平的关系。方法采用原位杂交的方法检测了14例进展期寻常型白癜风患者表皮角朊细胞ET-1 mRNA表达。结果　白癜风患者白斑区及白斑边缘角朊细胞ET-1 mRNA表达明显降低。结论　白癜风的发生可能与角朊细胞所分泌的ET-1等生长因子缺乏有关，角朊细胞ET-1表达水平降低的原因以及在白癜风发病中作用尚需进一步研究。

Study on the Expression of Endothelin-1 mRNA in Keratinocytes in Patients with Vitiligo　　Chang Jianmin, Zhu Tiejun, Ma Shengqing. Department of Dermatology, People′s Hospital of Beijing Medical University, 100044
　　【Abstract】　Objective　To study the expression of endothelin-1 (ET-1) mRNA in keratinocytes in patients with vitiligo. Methods　Fourteen patients with progressive vitiligo were measured by hybridization in situ. Results　Our results showed that the expression of ET-1 mRNA was markedly decreased. Conclusion　The results revealedthat decreased ET-1 expression may be associated with the pathogenesis of vitiligo. The cause and role of decreasing of ET-1 expression of keratinocyte in vitiligo lesion need to be studied further.
　　【Key Words】　Vitiligo　　Keratinocytes　　Endothelins

　　内皮素-1(endothelin-1, ET-1)是由21个氨基酸残基组成的强血管收缩肽，在维持人体系统及外周血管张力中起重要作用。ET-1还是许多细胞的促分裂剂，研究表明，角朊细胞能合成分泌ET-1并为黑素细胞的促分裂因子。我们应用地高辛标记的ET-1 RNA探针采用原位杂交的方法对白癜风角朊细胞ET-1 mRNA表达进行了检测，以了解角朊细胞ET-1 mRNA表达与白癜风发生的关系。

材料和方法

　　一、标本来源及制作
　　白癜风患者组：共14例，均为临床诊断明确的进展期寻常型白癜风患者(诊断根据全国色素病学组制定的诊断标准)。其中男10例，女4例；年龄18～56岁；病程3个月至20年；其中散发型12例，泛发型2例。所有患者近1个月内未接受皮质类固醇激素、免疫抑制剂、紫外线、光敏药物治疗，也未接受其它系统药物治疗；正常对照组：共8例，其中男女各4例，年龄18～61岁。所有皮肤标本均取于胸腹部，常规手术活检取材。白癜风组中，其中4例在白斑区、白斑边缘(白斑向外2～5mm白斑向正常皮肤移行处)取材，10例在白斑区、白斑边缘、白斑对侧且至少远离白斑10cm处正常皮肤处活检取材。正常人皮肤标本取自于胸腹部手术切口处。皮肤组织取下后立即置于10%的中性福尔马林溶液中固定24小时，脱水，石蜡包埋。切片厚为5μm，覆于涂有Apes的载玻片上，置于65℃的烤箱中烤片40分钟。
　　二、ET-1 RNA探针的制备
　　ET-1重组质粒由北京医科大学病理学系分子病理实验室提供。ET-1片段为1.1kb。将重组质粒转染大肠杆菌，进行质粒扩增，然后碱变性法提取质粒，用限制性内切酶EcoRⅠ将质粒DNA线性化。在T７ RNA聚合酶作用下体外转录合成地高辛标记的反义RNA探针，在SP６RNA聚合酶的作用下合成正义探针。
　　三、原位杂交
　　具体步骤如下：切片于二甲苯中脱蜡1小时，3次，然后于100%、90%、85%乙醇中水化，PBS清洗。切片组织上滴加0.1N HCl，室温下10分钟，然后PBS冲洗。组织在37℃用100μg/ml的蛋白酶K消化10分钟。PBS冲洗后，室温下吹干。滴加杂交液。在Ep管中每张切片加入下列成分：ET-1 RNA探针2μl，去离子甲酰胺10μl，SSD 1μl，50×Denhardts 2μl，硫酸葡聚糖2μl，1mol/L DTT 1μl，20×SSC 4μl，上述成分混匀后于80℃～90℃水浴中放置5分钟，然后滴于切片组织上，每张切片滴加20μl。切片置于盛有甲酰胺的湿盒中，42℃杂交16～20小时。杂交后2×SSC浸洗15分钟，2次，然后用1∶1000 RNase室温下消化5分钟。1×SSC浸洗15分钟，2次后，地高辛缓冲液Ⅰ浸洗5分钟。用地高辛缓冲液Ⅰ1∶100稀释的马血清37℃封闭30分钟。加用地高辛缓冲液Ⅰ1∶500稀释的地高辛抗体，37℃，30分钟。用地高辛缓冲液Ⅰ浸洗15分钟，2次后，用地高辛缓冲液Ⅲ浸洗3分钟，2次。滴加用地高辛缓冲液Ⅲ1∶100稀释的BCIP/NBT，避光显色15～30分钟。终止显色，二甲苯透明，封片。阳性结果判定：胞浆中出现蓝紫色信号为染色阳性。正义探针作阴性对照。
　　四、图像分析及统计学处理
　　采用MPI-400计算机多媒体彩色图文分析系统(同济太阳公司)对切片上的染色信号进行灰度分析。每个切片组织随机选取3个视野，测量单位面积平均灰度值。灰度值代表信号表达强度。各组之间平均灰度值差别采用方差分析。

结　　果

　　光镜下观察：白癜风患者白斑区、白斑边缘角朊细胞与白斑对侧皮肤角朊细胞(图1)及正常人皮肤角朊细胞(图2)比较，白斑区、白斑边缘角朊细胞ET-1mRNA表达明显降低。白斑区与白斑边缘角朊细胞比较，白斑区角朊细胞ET-1 mRNA表达低。白斑对侧皮肤角朊细胞与正常人皮肤角朊细胞ET-1 mRNA表达未见差别。

图1　白癜风患者白斑区、白斑边缘、白斑对侧角朊细胞

ET-1 mRNA表达

图2　正常人皮肤角朊细胞ET-1 mRNA表达

　　原位杂交染色经计算机图像分析，测量灰度值，各组间平均灰度值进行统计学检验，白斑区角朊细胞组(143.5±3.7)及白斑边缘角朊细胞组(158.6±6.1)平均灰度值明显低于白斑对侧皮肤角朊细胞组(183.5±6.5)及正常人皮肤角朊细胞组(177.4±4.3)(P<0.05)；白斑区角朊细胞组平均灰度值明显低于白斑边缘角朊细胞组(P<0.05)；白斑对侧皮肤角朊细胞组与正常人皮肤角朊细胞组平均灰度值无显著性差异(P>0.05)。

讨　　论

　　角朊细胞(KC)和黑素细胞(MC)是表皮中的两种主要细胞。白癜风的主要病理改变是表皮内的MC死亡消失［1］。MC死亡消失的机理尚不清楚。近年来体外研究发现KC对MC的生长分化有重要作用。KC不仅能特异地刺激MC生长，还能促进MC色素形成及树突生长［2～5］。KC对MC的作用机制，主要是通过KC产生一些生长因子来影响MC的生长、分化。
　　本实验研究对象均为进展期白癜风患者，不仅检测白斑区KC表达ET-1水平，对白斑边缘、白斑对侧皮肤KC的表达水平亦进行检测。实验发现进展期白癜风白斑区及白斑边缘KC的ET-1 mRNA表达较白斑对侧及正常人皮肤KC低，且以白斑区KC降低更为明显。白斑区KC比白斑边缘KC的ET-1 mRNA表达低，白斑边缘KC的ET-1 mRNA表达较白斑对侧及正常人皮肤KC低，这一结果符合进展期白癜风由白斑向边缘的疾病发展过程。进展期白癜风白斑区及白斑边缘KC的ET-1 mRNA表达比正常人KC低，也进一步证实了白癜风白斑及白斑边缘KC的异常。白癜风白斑区、白斑边缘KC表达ET-1显著低下的原因以及KC表达ET-1低下在白癜风发生中所起的作用及其相互的关系尚需进一步研究。